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Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 3625 (2023) Citer cet article

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La recherche basée sur les biopuces évolue actuellement vers une base tridimensionnelle et à grande échelle similaire au microenvironnement in vivo. Pour l’imagerie en direct et à haute résolution à long terme de ces échantillons, la microscopie non linéaire capable d’obtenir une imagerie sans étiquette et multi-échelle devient de plus en plus importante. La combinaison avec l’imagerie de contraste non destructive sera utile pour localiser efficacement les régions d’intérêt (ROI) dans les grands spécimens et, par conséquent, minimiser les photodommages. Dans cette étude, une microscopie à cohérence optique photothermique (OCM) sans étiquette constitue une nouvelle approche pour localiser le retour sur investissement souhaité dans des échantillons biologiques faisant l’objet d’une enquête par microscopie multiphotonique (MPM). La faible perturbation photothermique dans l'échantillon par le laser MPM à puissance réduite a été détectée au niveau des particules photothermiques endogènes dans la ROI à l'aide de l'OCM photothermique différencié en phase (PD – PT) très sensible. En surveillant le changement temporel du signal de réponse photothermique de l'OCM PD – PT, le point chaud généré dans l'échantillon focalisé par le laser MPM était localisé sur la ROI. Combiné au mouvement automatisé de l'échantillon dans l'axe x-y, le plan focal du MPM pourrait être efficacement dirigé vers la partie souhaitée d'un échantillon volumétrique pour une imagerie MPM ciblée haute résolution. Nous avons démontré la faisabilité de la méthode proposée en microscopie à génération de seconde harmonique en utilisant deux échantillons fantômes et un échantillon biologique, un insecte fixé sur une lame de microscope, de dimensions 4 mm de large, 4 mm de long et 1 mm d'épaisseur.

La microscopie multiphotonique (MPM) permet des analyses à haute résolution dans divers domaines de recherche biologique. Ces dernières années, l'utilisation du MPM a continué de gagner en attrait en imagerie biomédicale, en particulier dans les domaines de l'imagerie neuronale profonde in vivo et en direct chez les petits animaux1,2,3,4,5, de la détection précoce des tumeurs et de leur caractérisation6,7, 8,9, réseau vasculaire et imagerie organoïde dans son microenvironnement dans des bio-puces10,11,12. Il existe de nombreuses approches pour augmenter la profondeur d'imagerie, un champ de vision plus large (FOV) et raccourcir le temps de balayage volumétrique en adoptant des fluorophores appropriés13, une optique adaptative14, des mécanismes multifaisceaux et multifocaux15,16, en plus d'autres modifications similaires. dans la configuration optique qui a donné des variantes de systèmes d'imagerie MPM adoptables en fonction des besoins d'imagerie et des scénarios d'application 5,16,17,18,19,20,21.

Les photodommages et le photoblanchiment sont des facteurs critiques à prendre en compte dans l’imagerie multiphotonique. Un éclairage prolongé accompagné d'une puissance laser élevée nécessaire à l'imagerie multiphotonique sans étiquette entraîne un photomécanisme de lésion tissulaire qui entraîne une fluorescence accrue provoquant la mort cellulaire, largement appelée photodommage 22,23,24. Pour éviter l'apparition de photodommages dans les cellules vivantes, il faut veiller à ce que les paramètres d'imagerie soient bien inférieurs au seuil de photodommages, comme l'intensité maximale, le taux de répétition et les temps d'exposition (dwell) prolongés24. La plupart de ces paramètres peuvent être contrôlés par les systèmes de source et de détection. Plusieurs groupes de recherche ont étudié et proposé diverses approches pour supprimer les effets du photoblanchiment et des photodommages. La méthode la plus simple et la plus largement adoptée consiste à réduire la puissance d’éclairage totale d’une source lumineuse4,25,26. Cependant, cela réduit à son tour la sensibilité globale du système en raison du rapport signal/bruit réduit. Les approches alternatives signalées pour atténuer cet effet impliquent une méthode d'exposition à la lumière contrôlée qui contrôle spatialement la lumière exposée sur l'échantillon, l'utilisation d'un séparateur d'impulsions passif qui redistribue l'impulsion laser d'éclairage en sous-impulsions d'énergies égales et un balayage optique rapide. mécanisme qui réduit les photodommages en contrôlant l’éclairage et la collecte des émissions des spécimens27,28,29,30. De plus, grâce à la méthode d’éclairage par feuille de lumière, seul le plan focal de l’objectif de détection est efficacement éclairé31. Bien que ces méthodes soient utiles pour réduire les effets de photodommages et de photoblanchiment, un éclairage haute puissance à long terme est nécessaire lors de la recherche de régions d’intérêt (ROI) dans de grands échantillons avec de petits champs de vision et de longs temps de balayage volumétrique, entraînant ainsi des photodommages et un photoblanchiment.